细菌分离具体操作方法：
点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环，在酒精灯火焰上烧灼接种环，待冷，取待测菌液一环。
左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火焰，右手持接种环在琼脂表面的一端（即1区，约占整个平皿的1/6～1/5）涂布，划线时，接种环与琼脂表面呈 30°～40°的角度轻轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环通过1区划线数次，在2区作连续划线，各线条间隔要小，但不能重叠。划满平皿的1/5～1/4区域，划完2区不需烧灼接种环，继续通过2区数次，在3区作连续划线，如此反复至划完整个平皿。 接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将平皿的底朝上，放置在37℃孵箱内孵育24h。
取出后观察琼脂表面的菌落分布情况，注意观察最后1～2区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、色素等情况）。
细菌的生长状况观察：
普通琼脂平板
牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化氯化钠（NaCL） 5.0g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45℃倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入15～20ml培养基，培养基过少，划线分离时细菌的营养较少，菌落生长过小，菌落形态不易观察，培养基也易于干燥，不易在数天内对菌落形态进行观察。 在无菌平皿中，倒入溶化后50℃普通营养琼脂培养基，每皿约 20毫升，水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌株分区划线，28℃培养24h。 菌落形态观察：
大小：以毫米计。
形状：圆形、不规则形、放射状等。 表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。 边缘：整齐、波形、锯齿状等。 色素：有颜色，颜色，是否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。
细菌的鉴别法：
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。革兰氏染色过程：（结晶紫）初染 →（碘液） 媒染 →（95%乙醇） 脱色 →（番红花红） 复染。
初染：当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
媒染：碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
脱色：当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，革兰氏阴性菌结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来。 复染：革兰氏阳性细菌仍保留初染时的颜色，呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。 革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
材料：嗜水气单胞菌，葡萄球菌，革兰氏染色液；载玻片；显微镜等。 方法： 涂片：
（1）取载玻片一张，试净。
（2）用灭菌的接种环取生理盐水一滴，放于载玻片的（如被检材料是液体，可不加生理盐水）。
（3）左手斜持菌种管，右手将菌种管棉塞稍加转动，以便拔下。
（4）右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拔开菌种管棉塞，管口通过火焰，用接种环取少量菌（切不可过多）。
（5）管口再通过火焰，塞好棉塞。
（6）将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内，磨匀，涂成直径约1厘米大小的薄薄菌膜。 干燥：将玻片置于空气中，使其自然干燥。
固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜） 干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次，其目的是使细菌粘于玻片上，染色和冲水时不易脱落；且细菌为蛋白质，被热凝固后可保持完整形态。
固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 染色：初染 → 媒染 → 脱色 → 复染
初染：加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1～2分钟，水洗。 媒染：滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1分钟，水洗。
脱色：加95%酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复2～3次（约30秒）。水洗。 或用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色。约20～30秒钟，立即用水冲净酒精立即水洗。 复染：加番红花红（沙黄液、稀释复红等），染约1分钟。水洗、干燥。 镜检：干燥后用显微镜观察。革兰氏阴性菌成红色。革兰氏阳性均呈紫色。 以分散开的细菌革兰氏染色反应为准。过于密集的细菌染色后常常呈假阳性。 同法在同一载玻片上以大肠杆菌和葡萄球菌混合纸片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死及部分自行溶解，都常呈阴性反应。
结果与思考
在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和葡萄球菌被染成何种颜色？它们是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌？
作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能保证你的染色技术操作正确，结果可靠？
