２０１９,No．４
９ 饲料安全及品质控制 ３:/doi１０．７６３３．issn．１００３Ｇ６２０２．２０１９．０４．０１０j
饲料中７种霉菌毒素测定的研究
(//四川省饲料工作总站,)农业部饲料质量监督检验测试中心(成都)四川成都 ６１００４１
程传民,李 云,柏 凡,魏 敏,王宇萍,李 茂,樊淑娜
摘 要:建立了«饲料卫生标准»规定的全部７种霉菌毒素的液质联用仪的检测方法,解决了霉菌毒素检测过程中)/,相对标准偏差为１．定量限为(是一种简便、经济、准确度和灵敏８３．６％~１２３．６％;６２％~５．３２％;１．０~５０kggμ度高的检测方法.
关键词:饲料;霉菌毒素;检测;液质联用仪
()中图分类号:S８１６．１７ 文献标志码:A 文章编号:１００３－６２０２２０１９０４－００３９－０４
常见的问题.采用乙腈和水提取,通过多功能柱净化,用内标定量.结果表明,７种霉菌毒素平均回收率为
Studnthedeterminationof７mcotoxinsinfeedyoy
,,,,,,CHENGChuanＧminLIYuBAIFanWEIMinWANGYuＧinLIMaoFANShuＧnapg
)du６１００４１,China
(,,MinistrfariculturefeedqualituervisionandtestinenterofChenduFeedWorkStationofSichuanProvinceChenＧyogyspgcgg
accordinothe＂FeedHieneStandard＂,andthecommonproblemsintheprocessofmcotoxindetectionweresolved．AcetoＧgtygythattheaveraerecoverf７mcotoxinswas８３．６％Ｇ１２３．６％．Therelativestandarddeviationwas１．６２％Ｇ５．３２％．ThequantiＧgyoy)/,,tativelimitwas(１．０Ｇ５０k．Itisasimleeconomicalaccurateandsensitivedetectionmethod．ggpμ:;;;KEYWORDSfeedmcotoxindetectionLCＧMSy
,,nitrileandwaterwereextractedurifiedbultiＧfunctionalcolumnandquantifiedbnternalstandard．Theresultsshowedpymyi
ABSTRACT:Thedetectionmethodofall７mcotoxinsbiuidchromatorahasssectrometrLCMS)wasestablishedyylqgpympy(
是霉菌生长 霉菌毒素是霉菌的次生代谢产物,
１Ｇ２]
.研究表明,所导致的一个重要结果[霉菌毒素对
TM
,;乙酸铵(色谱纯)FlukaMcoSi４００多功能净化yp
动物的危害是全国性、全年性的,霉菌可以在不同地
]３Ｇ４
.饲料中霉菌毒素区、不同温度范围内繁殖产生[
;中检环贸)霉harm公司;EB１１４４０３多功能净化柱(公司.
柱,Romer公司;TCＧM１６０多功能净化柱,RＧbioＧp菌毒素标准品,霉菌毒素内标,Romer公司;Romer
对动物的生长危害较大,建立一种经济、快捷、准确
]５Ｇ６
.为解决饲度和灵敏度高的检测方法很有必要[
１．２ 色谱和质谱条件
(;柱温:进样体２１mm×１００mm,２４μm)３５℃;表１.
ThermoBDSHYPERSILC１８色谱柱:
料卫生标准中７种霉菌毒素同时检测,同时提供一个准确定量的筛查方法,本研究建立了７种霉菌毒素检测方法.１ 试验部分１．１ 仪器和试剂
/液质联用仪配有电喷雾源,美国Alient１２９０g
;/.流动相梯度洗脱条件见积:流速:１μl３００μlmin
离子源:电喷雾离子源;扫描模式:正负模式同
,电子天平(德国赛多利斯公司;涡６４９５;００１mg)旋振荡器,禾本森科有限公司;电动振荡器,美国
３０００V;干燥气温度:２５０℃;干燥器流速/;鞘气流速１１LminxEMV:３００V.监测离子对
时进行;毛细管电压:正模式３５负模式:００V;
/;;雾化气压力２鞘气温度３１０Lmin４１KPa５０℃;(/和其他参考条件参见表２.mz)
高速冷冻离心机,IKA公司;BiofurimoR公司.gP
收稿日期:修回日期:２０１８Ｇ１２Ｇ０３;２０１９Ｇ０３Ｇ２０
:(),,,作者简介程传民１９８０Ｇ男高级畜牧师主要从事畜产品安全工作.
)通讯作者:李 云(男,研究员,主要从事饲料及畜产品安全工作.１９６６Ｇ
,乙腈、甲醇(色谱纯)乙酸、FisherScientific公司;
１．３ 溶液配制
４０).提取液:乙腈水(Ｇ５０∶５０
饲料中７种霉菌毒素测定的研究/ 程传民等:２０１９年第４期
酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、TＧ２毒素、、、、、、伏马毒素B０１０１０１０５０５０ml１和B２混标储备液２用５配成质量浓０％乙腈水溶液定容到１０ml容量瓶,、、、、、/度分别为:４０１００１００１０５００２５０mgL的混合内标工作液,置于冰箱中２有效期３个月.~８℃保存,
１３
[内标工作液:分别取U黄曲霉毒素BＧCＧ１７]１、
标准工作液:分别取黄曲霉毒素B玉米赤霉烯１、,提取液,涡旋均质３m过２５mlin或者振荡９０min０５ml过滤后的上清液和２５μl乙酸注入McoＧy
TM
盖紧净化柱,剧烈涡旋振荡混Sin４００净化柱中,p
称取饲料样品５g于５加入０ml离心管中,
/,滤上清液,或将上清液在９０取００rmin离心５min
,合１m掰断净化柱底端,将净化柱放入离心管in/,中,以１取５００００rmin离心３０s０μl的样液与
表１ 液相色谱梯度洗脱条件
L－１乙酸铵/％１０mmol
８０１５５５
１３１３
[[玉米赤霉烯酮、UＧCＧUＧCTＧ２毒素同位１８]２４]１３１３
[[素、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰UＧCＧUＧCＧ２０]１５]１３
[刀菌烯醇和U伏马毒素BＧCＧ３４]１内标储备液
/内标工作液混合,上L５０μlCＧMSMS检测.
时间/min０．００６．０６．１８．０１２．０８．１
２０８５９５９５２０２０
甲醇/％
２００、５０、５０、５０、２００、５０ml用５％乙腈水溶液定容到/３１２５、１２５、１２５、３１２５mL.g１．４ 样品处理步骤
配成质量浓度分别为:２５ml容量瓶,２５、３１２５、
８０８０
表２ ７种霉菌毒素的质谱参数
呕吐毒素(＋)
名称(离子模式)
保留时间/min
２．３２５２．３２５４．８１９４．８１９５．８１３５．８１３６．０８９６．０９０６．４２９６．４２９６．５１６６．４２９６．４２９
()２９７．１８５
()３１２．２８８母离子
()２４９．１６
()２６３．２４定量离子
()２０３．１１４()２４１．１４０()３３４．３３８()１８５．２１２()３５８．１９()３１８．３４２
()１３１．２２５定性离子
１３[１３[
CＧdeoxnivalenoly１５]
黄曲霉毒素B＋)１(CＧaflatoxinB１７]１
()伏马毒素B１＋
()３１３．１１３０
()３３０．１１４０()７２２．４１８０()７５６．５１８６()４０４．０１０９()４２４．１１０８()７０６．４１７０()３１７．１１４８()３３５．２１５２()４８４．３９４()５０８．１８４
()２８５．１２１
()３０１．２１９()３５２．３３４()３７４．４３８()２３９．０２１()２５０．１１９()３３６．３３８()１７５．２２１()２９０．３１１()３０５．２３()３２２．３３
TＧ２毒素(＋)
１３[CＧTＧ２toxin２４]
１３[CＧfumonisinB３４]１
赭曲霉毒素A(＋)１３[CＧochratoxinA２０]
１３[CＧzearalenone１８]
伏马毒素B＋)２(玉米赤霉烯酮(－)
２ 结果与讨论
如果仪器灵敏度不足,可采用正负模式分段或者动态d 注:MRM提高灵敏度.
黄曲霉毒素和呕吐毒素时具有良好的净化效果,并且回收率较高,但玉米赤霉烯酮T赭曲霉毒Ｇ２毒素、多功能净化柱在黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和T并且回收率较Ｇ２毒素具有良好的净化效果,高;但赭曲霉毒素A和伏马毒素的回收率低.在上
TM
述条件下,采用McoSin４００多功能净化柱在７yp
种毒素的检出结果上得到了较为满意的净化效果和TM
回收率.因此,本研究选择McoSin４００多功能yp净化柱作为本方法的净化柱.
２．１ 提取条件的选择
目前,霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈及
]７Ｇ８
.本研究在此基础它们与水的混合溶液为提取剂[
素A、TＧ２毒素和伏马毒素的回收率低;EB１１４４０３
上,比较了５０％、７０％和８４％乙腈水溶液的提取效率,并对提取时间、提取方式等条件进行了比较,综合考虑选择５７种毒素提取效率,０％乙腈水溶液震荡
或均质搅拌３m９０minin提取.２．２ 多功能柱的选择
固相萃取净化方法是复杂基质中痕量检测进行净化的常用方法.在霉菌毒素多组分检测时,多采多功能净化柱、EB１１４４０３多功能净化柱和McoＧyTM
Sin４００多功能净化柱的净化效果进行了比较.p
在上述提取条件下,TCＧM１６０多功能净化柱在净化用多功能柱作为前处理方法.本研究对TCＧM１６０
２．３ 色谱柱的选择
霉菌毒素结构中多含有羧基和羟基,属于中等级性化合物,易溶于乙腈和甲醇等极性溶剂,在一般tersACQUITYUPLCBEHC１mm×５０mm,１８２的C本方法比较了WaＧ１８色谱柱上有较好的保留,
程传民等:饲料中７种霉菌毒素测定的研究/２０１９年第４期
１ ４和定量限(LOQ)见表４.
毒素名称DONFB１
线性方程３．４８x＋９２．２３y＝４
１２x－０．５２４y＝７．
１７μm;AilentSBＧC１mm×５０mm,１８μmg１８２和ThermoBDSHYPERSILC１mm×１８２
经使用标准工作液对各规１００mm,２４μm色谱柱,
格色谱柱进样分离得色谱质谱图.由试验结果可C１mm×１００mm,２４μm色谱柱峰型和灵敏度１８２
较好.标准液的总离子流图见图１.
表４ ７种霉菌毒素的线性关系和检出限
２R见,在本研究的液相条件下ThermoBDSHYPERSIL
AFB１７５．３x－７９８．６y＝１４
４１．７x＋１４１３．５y＝８
０．９９９１０．９９９８０．９９５２０．９９８９LODLOQ－１－１gkgμgkgμ１０．００．５０．５２５
２０．０１．０１．０５０
TＧ２
图１ ７种霉菌毒素标准品的总离子质谱图(MRM)
．４ 流动相的选择
要实现盟对各种黄曲霉毒素的限量要求７种霉菌霉毒素峰型对称,并且达到欧,必须选择最为合适的流动相.试验采用了甲醇水和乙腈水两种常用的流动相,为增加霉菌毒素的离子化效率ＧＧ,在水相中加入１０mmol/L的乙酸铵,经比较大部分霉菌毒素使用甲醇的灵敏度要高于乙腈,再加上甲醇比乙腈更加稳定,并能够在较短的时间内得到很好的峰型,最终确定用１０mmo/表３ 液相色谱梯度洗脱条件
.
lL乙酸铵和甲醇做流动相.流动相梯度见表３时间/甲醇/０１０mmol
L－１乙酸铵/
６．０min８％２％６．０．０１１０８０８５５９５８．．０８５
９５１２．１
０２５．５ ８００
２００
内标添加时间的选择
考察了样品中霉菌毒素的提取效率,在乙腈水(５０＋５０)充分提取下,７种霉菌毒素提取效率＋均高于考虑内标成本较高的情况下９０％,且多功能柱对霉菌,选择过多功能柱后加毒素的吸附很少,在内标.
．６ 方法的性能检验
不同种类霉菌毒素在MRM方式下的灵敏度除取决于毒素本身的结构原因外,主要与离子化的效率有关.将特定浓度的霉菌毒素加入到空白样品中,然后按本方法对样品预处理.经质谱检测,所得定量限均满足欧盟规定.线性方程、检出限(LOD)
OTyZFOB２
A
N
y＝＝８
１
３０７ ９４１．５x－２６５．５６．４２x－１．８９８０．y＝７
．９８x－４６６．８．９９９９８４６８０．５０．９９８４
０２．５１５．５００２．１．０方法的回收率及精密度
为考察方法的准确度,我们采用不同品牌的标准物质进行了试验,同时选择浓度相差较大的两个标准物质,每个水平平行测定８６份.平均回收率为
５３６％~１２３６％,相对标准偏差为１６表３表５２.
％,表明方法准确度、精密度良好.具体结果见２％~
５ ７种霉菌毒素平均回收率和相对标准偏差(n＝６
)毒素名称标物浓度mgDON２７kg－１检测均值２２gkg平均回收率％相对标准偏差
m－１％１４００１２５９７８．．５８１８
４２．AFB１１６０１２００１．．３２
１９３２．．６１４２．６．１６
１１４．５．３１４．７６FB１２００００１１５．３２３３０
７０２２７６．１１２．６５１７２．．９３４．２１TＧ２１２．３１３４６．２２３．１３９７３９．．５６９８８２．０８．０６OTA４．７２．６９９６．．８０
５８１FB２１９０５２０５．．２５７６
１１０２７３．．８６４．２１６０００６５．１９ZON
３３３８６３０．１１１０８．４
１１３．８５．２８２．８ １０７４．９１３８３．０．１．５２
１０００３．．８６１．２６２．．６３２８
常见问题分析
２．８．１ 伏马毒素回收率偏高的原因
和离子加强(１)离子效应的影响,而伏马毒素的离子效应为离子加强.离子效应分为离子抑制,在不能够完全抵扣离子效应的情况下,付马毒素的回收率就会偏高.
含量较高(２)标准品浓度的影响,如果标准品的峰面积和添加样品的峰面.一般样品中伏马毒素积不在一个数量级上,也会造成回收率就会偏高.看不到母离子造成伏马毒素质谱条件不准确(３
)伏马毒素响应低的影响.新建伏马毒素时,伏马毒素分子量较大,在仪器默认的锥孔电压下,不能够全部进入四级杆,需要在新建方法时增加锥孔电压.２．８．２ 呕吐毒素峰型差的原因
２２２ ４２()在配制标准品时,有机相含量高时会造成呕１
吐毒素峰型差,本研究为了标准品和样品的溶剂一致,采用的是提取液配制标准品;为了降低溶剂中有机相的比例,采取配制内标时用高比例的水相.()进样量较大时,也会造成呕吐毒素峰型差,２
.本研究进样量为１μl
饲料中７种霉菌毒素测定的研究/ 程传民等:２０１９年第４期
()可采用正负模式分段采集的方式,减少干３
扰,提高灵敏度.但分段的时间每次会存在偏差,需要检测时进行调整.
２．８．４ 使用器皿带来的影响
()玻璃容器:有报道说玻璃容器会对霉菌毒素１有吸附,需要进行硅烷化处理.经多次使用标准物质比较,发现两者没有显著性差异.
()滤膜:标样过不同滤膜后有一定损失,同一２
标准液过膜后和不过膜的比较见图２,伏马毒素对方式.
２．８．３ 玉米赤霉烯酮稳定性差的原因
()玉米赤霉烯酮采用负的离子模式,在离子源１中受干扰影响较大,刚开始时离子化率不稳定,需要较长时间的平衡.
()在流动相中添加乙酸铵,提高玉米赤霉烯酮２
的离子化率.
膜吸附最敏感.本研究采用高速离心后上机检测的
图２ 过膜前后样品的总离子流图
３ 结论
()前处理简单快速,减少氮吹等过程,适合大１批量样品的定量筛查.
()同时检测７种霉菌毒素,所有我国现在饲料２
中有限量标准的霉菌毒素均可以同时检测.()正、负离子同时检测,节约了检测时间和成３本,提高了检测效率.
()比较了３家多功能柱净化的效果.４
３
()采用１几种我国有限量标准的５C内标定量,
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添加剂学术暨新技术、新产品交流会»论文集,２００４．]()分析化学,１４种霉菌毒素及其类似物[J．２０１０,３８１２．
霉菌毒素均采用自己的同位素内标,检测结果更加科学、准确.方法前处理简便、快速,灵敏度、准确度高.能够适用于饲料及饲料原料中霉菌毒素的多组分检测.
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(责任编辑:舒莲梅)
