一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术[发明专利]

*CN102226142A*

(10)申请公布号 CN 102226142 A(43)申请公布日 2011.10.26

(12)发明专利申请

(21)申请号 201110116235.3(22)申请日 2011.05.06

(71)申请人江南大学

地址214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800

号(72)发明人许正宏 史劲松 陆震鸣 许伟(51)Int.Cl.

C12J 1/00(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12R 1/02(2006.01)C12R 1/125(2006.01)C12R 1/225(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页

(54)发明名称

一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术(57)摘要

本发明公开了一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术，属于生物工程技术领域。本发明的操作方法流程为：(1)酿醋功能性微生物的确定：采用PCR-DGGE等分子生态学技术解析固态酿造食醋醋醅中微生物群落的结构，结合与食醋产品品质和功能性相关的关键理化指标确定食醋酿造过程的功能性微生物；(2)酿醋功能性微生物菌株的纯培养：采用微生物纯培养技术从食醋醋醅中获得酿醋功能性微生物菌株；(3)食醋发酵过程的生物强化：选用食醋酿造功能性微生物菌剂或其组合，在食醋固态发酵阶段进行生物强化。该方法具有缩短食醋酿造周期、改善并控制食醋产品风味品质及功能性、提高原料利用率等优点。

CN 102226142 ACN 102226142 ACN 102226149 A

权 利 要 求 书

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1.一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术，其特征在于酿醋生物强化技术按以下步骤进行：

(1)醋醅微生物群落总DNA的提取。选择正常发酵过程的醋醅2g，采用液氮研磨、溶菌酶处理、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化等步骤提取基因组DNA。

(2)合成引物并利用PCR扩增技术，扩增出细菌16S rDNA V3区序列。(3)利用电泳仪对扩增的16S rDNAV3片段进行DGGE分析。其条件为：8％聚丙烯酰胺凝胶，30％～50％变性梯度(100％变性剂浓度为7M尿素，40％甲酰胺)，上样量为200ng，缓冲液为1×TAE，60℃，200V电压电泳4h，SYBRGreen I染色45min。

(4)优势微生物的序列测定。选择DGGE胶上10～20个最为显著的条带，切割胶条，并进行序列分析，在GenBank中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属。

(5)功能性微生物筛选。利用醋酸菌、乳酸菌发酵培养基培养基，以醋醅为筛选样品，筛选醋醅中醋酸菌、乳酸菌等微生物。挑选生长较快、分布密度较大但菌落形态不同的20～30株菌落，纯化后保存。

(6)功能性微生物的确定。对上述筛选获得的纯培养微生物进行16S rDNA测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择2～5株优势微生物用于生物强化。若本步骤未获得优势微生物，则按照功能性微生物筛选方法进行重复筛选和鉴定。

(7)生物强化菌株的预培养，采用斜面、三角瓶、一级种子、二级种子扩培方法，对生物强化的菌株进行扩大培养，培养至对数生长期。

(8)醋酸发酵过程的生物强化。将上述培养的菌株种子液，按照固体发酵培养基的1～2％的接种量，于醋酸发酵开始的1～7天进行接种，其中强化所用的醋酸菌直接添加到醋醅的表面，而乳酸菌拌入到培养基底部。生物强化每批次可进行1～3种微生物的强化，可以同时开展，也可以分开进行，其最优强化方案应根据效果进行选择。

2.根据权利要求1中所述的用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术，其特征在于，所述步骤(5)中的醋酸菌培养基为：葡萄糖1％，酵母膏1％，pH 5.5，121℃灭菌20min，冷却至55℃以下加入6％(v/v)的无水乙醇；所述的乳酸菌筛选培养基为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，KH2PO40.1％，K2HPO40.25％，MgSO40.1％，NaCl 0.25％，pH 7.0，121℃灭菌20min，冷却至55℃以下加入6％(v/v)的无水乙醇。

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说 明 书

一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术

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技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术。

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背景技术

酿醋工业是我国生物技术产业的重要组成部分，2009年我国食醋产量达400万

吨，居世界首位。食醋的酿造方法可分为固态发酵和液态发酵两大类。我国的食醋大多采用传统“固态开放式多菌种混合发酵酿醋工艺”，即醋酸发酵时物料呈固态的酿醋工艺。该方法酿制的食醋不仅具有酸味，还具有独特的风味和保健功能。食醋发酵过程中，醋酸等风味物质以及川芎嗪等功能性物质的生成是一个十分复杂的生化和物化反应过程，其中主要以微生物的代谢作用为主。传统的食醋固态发酵工艺包括淀粉质原料的酒精发酵、酒精醪的固态好氧醋酸发酵和厌氧封醅陈酿等主要步骤，其中好氧醋酸发酵是食醋发酵的关键步骤，所用的发酵剂主要为前一批次发酵成熟的醋醅，发酵过程中不接种纯培养醋酸菌，因而食醋发酵微生物的主要来源是接种用醋醅中的微生物菌群，包括各种醋酸菌、乳酸菌、霉菌、酵母菌等，同时也受到生产原料、车间环境微生物的影响。[0003] 迄今为止，包括我国众多的传统名优醋在内的食醋行业，生产过程以传统的经验为主，发酵过程中醋醅温度偏高或偏低，出现异味、产率下降等异常现象时有发生，存在批次产品品质，尤其是风味差异较大等问题。究其原因，主要还是对我国传统的酿醋工艺机理的理解，尤其是对酿造过程中微生物的组成、功能等了解甚少，这在很大程度受限于研究方法(微生物纯培养技术)和化学分析仪器的缺陷。例如，环境中可培养的细菌不到细菌总数的0.1％，因此对醋醅中的微生物，尤其是功能性微生物知之甚少，这将难以使我们全面揭示醋醅中微生物的作用机制。[0004] 近年来，随着分子生态学技术的迅速发展，人们可以快速地扩增遗传物质的DNA，从而从基因水平上来研究特定环境中微生物的功能，这在很大程度上有助于人们了解复杂微生物环境的信息。国内外很多研究人员把分子生态学技术运用到对粪便、土壤、海底污泥、污水等体系中原核生物和真核生物的微生态研究中，同时在传统发酵食品领域也有非常广泛的应用，其中包括墨西哥发酵玉米团、日本黑醋、朝鲜泡菜、奶酪意大利香肠等的微生物组成和分布的研究，取得了令人瞩目的成果，为我们更好地了解国内外传统发酵的机理提供了理论基础，同时也为传统发酵行业的改革和进步提供了非常宝贵的理论数据支撑。

[0005] 本发明基于微生物强化技术，主要通过对食醋酿造微生物的群落优化，达到缩短发酵周期、提高出醋率和原料利用率，改善和提高食醋风味品质。生物强化技术(Bioaugmentation)，又叫生物增强技术，产生于20世纪70年代中期，80年代后已在废水处理、城市垃圾处理、土壤修复等领域得以研究和应用。目前，在传统发酵食品生产领域中应

①对于很多传统发酵食品中微生物菌种的用生物强化技术的研究鲜有报道。主要原因有：

研究开展得尚不深入，其菌落结构中起到主导作用的优势菌群的组成及其功能的信息也还

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说 明 书

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知之甚少，而这些正是生物强化研究开展的前提；②食品安全问题越来越成为食品生产领域关注的焦点，如果采用外源菌种或者高效基因工程菌进行生物强化研究，其潜在的生物安全性问题目前并没有得到很好地解决，这就直接制约了生物强化技术在传统发酵食品生产行业的应用。发明内容

本发明的目的在于解决上述现有食醋固态酿造技术的不足，提供了一种生物强化

技术用于固态酿造食醋的发酵过程，以优化食醋酿造微生物群落结构，缩短食醋酿造周期、改善食醋产品风味品质及功能性、提高原料利用率，更好的发挥微生物资源在固态发酵中的应用。

[0007] 本发明的目的通过以下方案实现：[0008] 1.酿醋功能性微生物的确定：采用PCR-DGGE等分子生态学技术解析固态酿造食醋醋醅中微生物群落的结构，结合与食醋产品品质和功能性相关的关键理化指标确定食醋酿造过程的功能性微生物。

[0009] 醋醅中微生物总DNA提取方法采用液氮研磨+溶菌酶+SDS高盐抽提法，醋醅中微生物群落结构采用PCR-DGGE技术进行解析。[0010] 2.酿醋功能性微生物菌株的纯培养：根据分子生态学分析结果，合理设计微生物培养条件，采用微生物纯培养技术从食醋醋醅中获得酿醋功能性微生物菌株。通过[0011] 3.食醋发酵过程的生物强化：选用食醋酿造功能性微生物菌剂或其组合，在食醋固态发酵阶段进行生物强化。

[0012] 该方法具有缩短食醋酿造周期、改善并控制食醋产品风味品质及功能性、提高原料利用率等优点。

[0013] 具体实施路线如下：

[0014] 醋醅微生物群落总DNA的提取。选择正常发酵过程的醋醅2g，采用液氮研磨、溶菌酶处理、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化等步骤提取基因组DNA。[0015] 合成引物并利用PCR扩增技术，扩增出细菌16S rDNAV3区序列。[0016] 利用电泳仪对扩增的16S rDNAV3片段进行DGGE电泳。其条件为：8％聚丙烯酰胺凝胶，30％～50％变性梯度(100％变性剂浓度为7M尿素，40％甲酰胺)，上样量为200ng，缓冲液为1×TAE，60℃，200V电压电泳4h，SYBR Green I染色45min。

[0017] 优势微生物的序列测定。选择DGGE胶上10～20个最为显著的条带，切割胶条，并进行序列分析，在GenBank中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属。[0018] 功能性微生物筛选。利用醋酸菌、乳酸菌发酵培养基培养基，以醋醅为筛选样品，筛选醋醅中醋酸菌、乳酸菌微生物。挑选生长较快、分布密度较大但菌落形态不同的20～30株菌落，纯化后保存。

[0019] 功能性微生物的确定。对上述筛选获得的纯培养微生物进行16S rDNA测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择2～5株优势微生物用于生物强化。若本步骤未获得优势微生物，则按照功能性微生物筛选方法进行重复筛选和鉴定。[0020] 所述的醋酸菌培养基为：葡萄糖1％，酵母膏1％，pH 5.5，121℃灭菌20min，冷却至55℃以下加入6％(v/v)的无水乙醇；所述的乳酸菌筛选培养基为：葡萄糖2％，蛋白胨

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说 明 书

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1％，酵母膏0.5％，KH2PO40.1％，K2HPO40.25％，MgSO40.1％，NaCl 0.25％，pH 7.0，121℃灭菌20min，冷却至55℃以下加入6％(v/v)的无水乙醇。[0021] 生物强化菌株的预培养。采用斜面、三角瓶、一级种子、二级种子扩培方法，对生物强化的菌株进行扩大培养，培养至对数生长期。

[0022] 醋酸发酵过程的生物强化。将上述培养的菌株种子液，按照固体发酵培养基的1～2％的接种量，于醋酸发酵开始的1～7天进行接种，其中强化所用的醋酸菌直接添加到醋醅的表面，而乳酸菌拌入到培养基底部。

[0023] 生物强化每批次可进行1～3种微生物的强化，可以同时开展，也可以分开进行，其最优强化方案应根据效果进行选择。

附图说明：

[0024] 图1醋醅微生物群落的DGGE分析图谱[0025] 图2微生物培养流程

[0026] 图3酿醋功能性微生物的培养过程曲线[0027] 图4生物强化过程的醋醅温度变化[0028] 图5生物强化过程的醋醅总酸变化

具体实施方式

[0029] 实施例1：醋醅微生物群落总DNA的提取[0030] 1.醋醅样品预处理[0031] 取2g醋醅样品，用20mL 0.1M的PBS(pH 7.0)悬浮，加入玻璃珠，vortex充分振荡5min；200×g离心5min，收集上清(含菌体)，弃取沉淀；洗涤3次；9000×g高速离心5min。弃上清，收集沉淀；收集的菌体用5mL 0.1M的PBS(pH 7.0)悬浮，9000×g离心；洗涤3次；洗净的菌体悬浮在1mL PBS(pH 7.0)中，用吹打后vortex振荡均匀，转入1.5mLEP管中，-20℃冻存备用。

[0032] 2.醋醅基因组DNA的提取[0033] 称取2g醋醅，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50mL离心管。向离心管中加入6mL DNA抽提缓冲液和100μL溶菌酶(50mg/mL)，于225r/min摇床上37℃摇动30min。向离心管中加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴2h，每隔15～20min轻轻颠倒几下，室温6000×g离心10min。收集上清。

用等体积的氯仿-异戊醇(24∶1体积比)抽提一次，以0.6倍体积的异丙醇室

温沉淀1h，16000×g离心20min，收集核酸沉淀，用冷的70％乙醇洗涤沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100μL TE中，加入终浓度为0.5μg/mL RNaseA，并在37℃下水浴消化2h，以去除RNA，置于-20℃冰箱保存备用。[0035] 实施例2：PCR-DGGE技术解析醋醅微生物群落的结构[0036] 1.PCR扩增

[0037] 细菌16S rDNA V3区PCR扩增所用的引物P2-P3可以扩增16S rDNA V3区约196bp的片段，对应E.coli16S rDNA 341到534的位点。[0038] 2.DGGE分析

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细菌16S rDNA V3区PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并用DyNA QuantTM 200浓度仪(Hoefer Pharmacia Biotech)测定DNA浓度。用Bio-Rad DCode DGGE系统进行电泳。DGGE电泳条件为：8％聚丙烯酰胺凝胶，DGGE采用30％～50％变性梯度(100％变性剂浓度为7M尿素，40％甲酰胺)，上样量为200ng。电泳缓冲液为1×TAE，60℃，200V电压电泳4h，SYBR Green I染色45min，UVP2GDS8000凝胶成像系统(Ultraviolet Product L.td)成像。结果如图1所示。[0040] 3.割胶测序

[0041] 对图1中的各条带进行割胶测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，结果如表1所示。

[0042] 表1醋醅微生物群落的鉴定结果

[0043]

实施例3：酿醋功能性微生物的筛选

[0045] 从镇江香醋醋醅中取10g样品装入混有玻璃珠和90mL无菌水的500mL三角瓶中，在37℃摇床上以115r/m振荡30min，然后取菌悬液1mL用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以10-2、10-3和10-4梯度稀释样涂布GYC平板，37℃培养48～72h；根据其在GYC平板上有无透明圈来判断是否是产酸菌，然后挑取透明圈明显、菌落丰厚的菌落经分离纯化后接入斜面培养基，37℃培养48h，4℃保藏。

[0044]

分离培养基(GYC)：葡萄糖1％，酵母粉1％，蛋白胨0.3％，轻质CaCO30.5％，琼脂2％，121℃0.1Mpa灭菌20min，等降温至55℃左右加入无水乙醇6％(v/v)。[0047] 斜面培养基(肉汤)：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，NaCl 0.3％，琼脂2％，pH 7.0-7.2，115℃灭菌20min。

[0048] 根据分离培养基中透明圈大小挑取菌株，并且在添加乙醇的液体培养基上验证有机酸产量，并结合其在平板上的菌落形态，得到3株高产有机酸的细菌，经鉴定分别为巴斯德醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。菌种于4℃置于斜面培养基中保藏以备进一步分析。

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实施例4：酿醋功能性微生物的纯培养[0050] 1.发酵培养基[0051] (1)醋酸菌、芽孢杆菌发酵培养基[0052] 葡萄糖1％，酵母膏1％，pH 5.5，121℃灭菌20min，冷却至55℃以下加入6％(v/v)的无水乙醇。

[0053] (2)乳酸菌发酵培养基[0054] 葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，KH2PO40.1％，K2HPO40.25％，MgSO40.1％，NaCl 0.25％，pH 7.0，121℃灭菌20min，冷却至55℃以下加入6％(v/v)的无水乙醇。[0055] 2.发酵条件

[0056] 生物强化用微生物的发酵采用三级扩大培养，其流程如图2所示。[0057] 为保证菌种活力，发酵过程中每隔2h取样，测定OD600吸光度，绘制微生物的生长曲线，如图3所示。[0058] 从图3发现，巴斯德醋酸菌的对数期为12～20h，枯草芽孢杆菌的对数期为6～12h，而戊糖乳杆菌的对数期为8～14h。为了保证生物强化用微生物的活力，故选取3株菌发酵至对数中后期的发酵液作为种子液进行生物强化试验，这期间的微生物活力较强，强化效果最好。

[0059] 3.微生物计数[0060] (1)醋酸菌、芽孢杆菌计数培养基

[0061] 计数培养基在4.1.2.2.1(1)中醋酸菌、芽孢杆菌发酵培养基基础上添加2％琼脂。

[0062] (2)乳酸菌计数培养基[0063] 下层培养基：在4.1.2.2.1(2)乳酸菌发酵培养基基础上添加2％琼脂。[00] 上层培养基：2％琼脂。[0065] (3)计数方法

[0066] 稀释平板菌落计数法(醋酸菌、芽孢杆菌计数)：取发酵完成的菌液用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以合适梯度涂布平板计数。37℃培养2-3d。及时观察菌落生长状况、形态并进行菌落计数。

[0067] 双层平板计数法(乳酸菌计数)：取发酵完成的菌液用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以合适梯度涂布平板。待平板充分吸收液体之后，将冷却至55℃左右的上层培养基倾注至下层培养基表面并完全覆盖下层，确保其厌氧的环境。37℃培养2-3d。及时观察菌落生长状况、形态并进行菌落计数。

[0068] 根据上述的两种不同的平板菌落计数方法对3株菌进行活菌技术，结果表明，3株强化用菌发酵结束后的浓度分别为：巴斯德醋酸菌：1.1±0.3×109cfu/mL、戊糖乳杆菌：4.2±0.6×107cfu/mL、枯草芽孢杆菌：6.2±0.5×109cfu/mL。[0069] 实施例5：食醋发酵过程的生物强化[0070] 1.原料

[0071] 本实施例所选取的发酵食醋醋酸发酵醋醅的主要原料是麸皮和大糠，再和一定比例的酒醪均匀混合后发酵。具体详情见表2。[0072] 表2发酵醋醅原料

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[0073]

2.强化策略[0075] 对照组：如表2中所示的原料添加量加入130kg酒醪和50kg麸皮于大缸中，搅拌混匀。接入8kg种醅，在醋醅上适当漂水，然后在醅上加盖一层大糠。[0076] 醋酸菌、芽孢杆菌强化组：原料和种醅加入之后，将强化用的2株菌的发酵菌液均匀撒至醋醅表面，然后在醅上加盖一层大糠。[0077] 乳酸菌强化组：将乳酸菌发酵菌液加至下层醪中，其余操作方法同对照组。[0078] 3.强化效果[0079] (1)温度

[0080] 3株菌的强化醋醅的提温速率均较对照醋醅快，强化第3天即达到46℃左右，而对照组醋醅的品温到第8天才提温至46℃左右(图4)。

[0074]

(2)总酸

[0082] 强化醋醅中的总酸从第8天开始均较对照醋醅高，分别为4.7、4.5、4.7和4.3g/100mL。而到发酵结束(第15天)时，芽孢杆菌强化的醋醅中总酸含量最高，为7.8g/100mL；醋酸菌强化的醋醅中总酸含量其次，为7.4g/100mL；乳酸菌强化醋醅的总酸最低，为7.1g/100mL。对照醋醅在发酵结束(第19)天时总酸达到7.6g/100mL。三种通过生物强化的醋醅发酵结束时醋醅中的有机酸含量达到或超过了正常生产对照醋醅19天的水平。

[0083] (3)主要有机酸

[0084] 通过HPLC对醋酸发酵结束醋醅中的有机酸进行分析，结果如表3所示。3种微生物强化后发酵15天的成熟醋醅中乙酸、乳酸和总有机酸的含量均超过正常生产成熟醋醅(第18天)的水平。

[0085] 表3采用生物强化技术生产的食醋中乳酸和乙酸的含量(g/100mL)

[0081] [0086]

(4)川芎嗪

[0088] 通过对食醋醋酸发酵过程进行生物强化，可以提高和加快川芎嗪的生成速率。在对照醋醅中，醋酸发酵前12天未检测出川芎嗪；从第12天开始，川芎嗪才开始逐渐产生，到醋酸发酵结束时(19天)其含量达到4.02μg/g干醅。而在强化组中，川芎嗪在前9天未

[0087]

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检测出，而到发酵结束时(15天)，川芎嗪含量分别达到7.45、4.31和6.71μg/g干醅。通过生物强化除了可加快川芎嗪的合成速率之外，其含量也较对照醋醅有明显提高，分别提高了85.32％、7.21％和66.92％。

[00] 表4生物强化过程醋醅中川芎嗪含量变化(μg/g干醅)

[0090]

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图1

图2

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图3

图4

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图5

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