中国实验诊断学２０１１年４月第１５卷第４期 ６０９－－－—— 文章编号：１００７—４２８７（２０１１）ｏ４—０６Ｏ９～０２ 苯甲酰芍药甙对冠心病模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 张二力 ，李 洋 ，戈宏焱 ，洪英杰 ，董宇翔 ，许 丹 ，李有田 ，华树成 （１．吉林大学第一医院中医科，吉林长春１３００２１；２．北京大学医学部基础医学院，北京１０００８３） 摘要：目的探讨苯甲酰芍药甙对冠心病模型大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法高脂饲料饮食制备冠心病大鼠 同正 动物模型，给予苯甲酰芍药甙灌胃治疗４周，采用免疫组化方法检测心肌组织中Ｂｃ１．２、Ｂａｘ的蛋白表达。结果与模型组对比差异显著（Ｐ＜０．０５），同正常组比较无显著差异性（Ｐ＞０．０５）。结论甙可能通过抑制心肌细胞的凋亡而治疗冠心病。 关键词：苯甲酰芍药甙；冠心病；细胞凋亡；ｂａｘ；Ｂｃｌ一２ 中图分类号：Ｒ５４１．４ 文献标识码：Ａ 常组比较，模型组大鼠Ｂｅｌ一２显著降低而Ｂａｘ表达增高（Ｐ＜０．０５）；治疗后，治疗组大鼠Ｂｃｌ一２表达增高、Ｂａｘ表达降低， 苯甲酰芍药甙可显著提高冠心病 大鼠Ｂｃｌ一２蛋白的表达（Ｐ＜０．０５）、抑制Ｂａｘ蛋白表达、增加Ｂｅｌ一２／Ｂａｘ比值，从而抑制心肌细胞凋亡。提示苯甲酰芍药 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆＢｅｎｚｏｙｌｐａｅｏｎｉｌｏｒｉｎ ｏｎ ａｐｏｐｔｆｏｓｉｓ ｏｆ Ｒａｔｓ ｔｌｌ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ＺＨＡＮＧ Ｅｒ－ｌｉ ，ＬＩ Ｙａ％ｏ２，ＧＥ Ｈｏｎｇ－ｙｏｎ ，ｅｔ ｏ１．（１．Ｆｉｒｓｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｏｓｐｉｔ１０ ｏｆＪｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｃｈｕｎ １３（１３２１，Ｃｈ／ｎａ；２．Ｂ￣０／＂＇ｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｍｉｔ，Ｂｅｉｉｆｎｇ １０００８３，Ｃｈ／ｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ Ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏｙｌｐａｅｏｎｉｌｆｏｒｉｎ Ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒａｔｓ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｆａｔ ｆｎｏｄｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｄ ｂｅｎｚｏｙｌｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ ｗｅｒｅ ｇｉｖｅｎ ｆｏｒ ４ ｗｅｅｋｓ．Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｎｌｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｉｎｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ，Ｂｃｌ一２ ｉｓ ｌｏｗｅｒ ａｎｄ Ｂａｘ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）；Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｂｃｌ一２ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ Ｂａｘ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｒｔｅａｍｅｎｔｔ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ａｂｏｕｔ Ｂｃｌ一２ ａｎｄ Ｂａｘ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｂｕｔ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｇｒｅａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｅｎｚｏｙｌｐａｅｏｎｉｌｆｏｒｉｎ ｃａｎ ｒｅｓｔｒａｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｔｌ１ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｂａｘ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｂｅｎｚｏｙｌｐａｅｏｎｉｌｏｒｉｆｎ ｍａｙ ｔｒｅａｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｅｎｚｏｙｌｐａｅｏｎｉｌｏｒｉｆｎ；ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｂｃｌ一２；Ｂａｘ （Ｃｈｉｎ Ｊ／ａｂ Ｄ／ａｇｎ，２０１１，１５：０６０９） 近年来，随着人们生活水平的提高，冠心病出现 中山生物工程有限公司；苯甲酰芍药甙购买于吉林 大学药物化学研究室；复方丹参滴丸（天津天士力制 药）；胆固醇（ＡＲ级）；胆盐３号（国药集团化学试剂 有限公司１７２００７０８２３）；猪油自制。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＰＭ２１０ＡＤ 显微镜，日本。 １．２实验方法 发病率高及死亡率居高不下等特点，对冠心病的防 治已成为医学界和社会关注的重要课题。赤芍为传 统的活血化瘀类中药，具有清热、凉血、止血和活血 止痛等作用…ｉ，对冠心病心肌损伤有改善及保护作 用，但其作用机制尚不完全清楚。苯甲酰芍药甙是 赤芍的有效成分之一，本研究通过对冠心病模型大 １．２．１模型的制作及分组健康Ｗｉｓｔｅｒ￣性大鼠４０ 鼠的治疗，观察凋亡蛋白Ｂｃ１．２和Ｂａｘ的表达，探讨其 对心肌细胞的保护作用和明确苯甲酰芍药甙心肌保 护效应的分子机制，为临床应用提供实验理论依据。 １材料与方法 只，体重１８０—２００ ｇ，由吉林大学预防医学院提供。 饲养于１８℃ ２２￣Ｃ、明暗各１２ ｈ的清洁级动物实验 室。按空腹体重随机分为４组，每组１０只。正常组 始终给予标准饮食。模型组、实验组１、实验组２均 给予由１０％猪油、１０％胆固醇、０．２％胆盐和７８．８％ １．１主要试剂、材料与仪器 Ｂｃｌ一２单克隆抗体、Ｂａｘ 小鼠抗大鼠单克隆抗体，北京中山生物工程有限公 司进口Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ分装）；生物素标记羊抗小鼠抗体； 辣根过氧化物酶标记的链亲和素和羊血清购自北京 普通饲料配制成的高脂饲料８周＿２ Ｊ。禁食水１２小 时，正常组和模型组各随机处死两只，检测心脏病 理，确认造模成功。造模成功后，模型组给予生理盐 水灌胃，２ ｍｌ／日；实验组１每日给予苯甲酰芍药甙 （１７０ ｍｇ／ｋｇ），实验组２每日给予复方丹参滴丸溶液 （１７０ ｍｇ／ｋｇ），连续用药４周。 基金项目：吉林省科技厅资助课题（２００３０９０３） ＊通讯作者 ６１０— Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａ￣ｎ，Ａｐｒｉｌ，２０１１，ｖ０１ １５，Ｎｏ．４ １．２．２免疫组化检测心肌组织中Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ的蛋白 表达各组大鼠在１０％水合氯醛（０．３ ｍＬ／１００ ｍｇ）麻 厚连 醉下取心脏，冷藏的生理盐水将血液冲洗干净，组织 块经１０％多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，５ 的蛋白表达密不可分。 Ｂｃ１．２家族是最先注意到与细胞凋亡有密切关 系的基因之一，按功能可分为两大类：一类是抗凋亡 蛋白，以Ｂｃ１．２为代表，主要分布于线粒体、内质网及 细胞质中［ ，具有抗细胞凋亡作用，Ｂｃｌ一２基因在滤 续切片，二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后，按说明书操 作，在光学显微镜视野下观察，阳性着色为棕黄、棕褐 及浅黄色胞浆。阳性标准诊断参照ＪｏｅｎＳｕｎ标准，阴 泡性Ｂ淋巴细胞瘤中由１４号染色体和１８号染色体 易位而活化，编码Ｂｃｌ一２蛋白，与线虫的生存基因 ｃｅｄ９有同源性，可抑制细胞凋亡。研究发现Ｂｃ１．２ 性对照用ＰＢＳ液代替抗Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ蛋白抗体。应用 Ｉｍａｇｅ—ｐｒｏＰｌｕｓ软件进行统计学处理，随机计数１０个视 的过表达可促使细胞提高对各种致命因素的抵抗 野计算灰度值，然后取平均值作为该切片的灰度值。 力，延长细胞寿命＿９ ；另一类是促凋亡蛋白，以Ｂａｘ 灰度值越高，表明凋亡蛋白表达量越大。 为代表，主要分布于细胞质中，具有促细胞凋亡作 １．２．３统计学处理所有数据均以均数±标准差 用，其表达可促使细胞凋亡。 （ －４－ｓ）表示，应用ＳＰＳＳ１６．０分析软件作方差分析处 赤芍为我国传统的活血化瘀类中药，因其有效 理数据，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。 成分单萜类及没食子鞣质等对心血管疾病具有治疗 ２结果 作用而受到人们的广泛重视【加Ｊ。苯甲酰芍药甙是 ２．１各组大鼠心肌病理ＨＥ染色正常对照组大 其主要化学成份，因此对其研究意义重大。已有 鼠心肌纤维排列整齐，心肌细胞无肿胀，细胞核无改 究表明，苯甲酰芍药甙具有改善心肌缺血、缺氧，清 变，元间质水肿。模型组大鼠心肌纤维排列紊乱明 除氧自由基等多种功效。本实验结果表明，苯甲酰 显，肌纤维肿胀，较多炎细胞浸润，心肌问质水肿，脂 芍药甙具有既能上调Ｂｃｌ一２表达，同时又能下调Ｂａｘ 质沉着明显，部分区域见有明显局灶性坏死，细胞核 表达的作用，因此能增加ｂｃ１．２／Ｂａｘ比值，有助于抑 萎缩。应用苯甲酰芍药甙的实验组１大鼠心肌排列 制心肌细胞凋亡，这可能是其治疗冠心病的途径之 较整齐，肌纤维轻度肿胀，细胞核萎缩，心肌间质水 但是其如何引起上述改变的机制有待进～步研 肿，无脂质沉着。 究探讨。 ２．２各组心肌中细胞凋亡蛋白表达量的比较 作者简介：张二力（１９７０一），男，主治医师，在读博士，主要从 事中西医结合临床工作。 Ｔａｂｌｅ：ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎ 参考文献： ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ（ｇｒｅｙｌｅｖｅ１） ［１］李晓如，梁逸曾，杨辉．川芎．赤芍挥发油的ＧＣ／ＭＳ分析［Ｊ］．高 等学校化学学报，２００６，２７（３）：４４３． ［２］张东，武海军，陈士萍，等．大鼠实验性高脂血症五种造模方法 的比较［Ｊ］．中国药理学通报，２００７，２３（９）：１２５４． ［３ ３张明雪，常艳鹏，刘宁，等．建立冠心病阳虚血瘀证动脉模型的 Ａｓｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆｔａｔｂｅ．Ｂｃｌ一２ ａｎｄ Ｂａｘｉｎ ｎｏｍ￣ａｌ ｇｒｏｕｐ ｈａｖｅ ｇｒｅａｔ ｄｉｆｅｌ￣ｅｒｌｅｅ 若干问题探讨［Ｊ］．亚太传统医药，２００７，３（１２）１７． ｗｉｈｔｔｈａｔｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｂｃｌ－２ｉｎｔｒｉａｌ１ｉｓ ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎ ［４］廖泽云，姜锦林，刘红．生脉散对实验性高脂血症大鼠血液流变学 ￣ｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．０５）；Ｂａｘｉｎｔｉｒａｌ １ ｉｓ ｌｏｗｅｒｔａｈｎｔｈｔａ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ 及抗氧化作用的实验研究［Ｊ］．辽宁中医杂志，２００７，３４（１０）：１４７８． （Ｐ＜Ｏ．０５）；ｔｈｅｍｉｓ ｎｏ ｇｒｅａｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ａｂｏｕｔ Ｂｃｌ一２ａｎｄ Ｂａｘｉｎｔｒｉｌａ１、ｔｒｉｌａ ［５１Ｍｏｔｔ Ｃ，Ｍｅａｄｏｗｓ ＡＢ，Ｈｅｒ Ｋ．Ｌｏｗ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍａｄ ｎｏｎｅａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｍｏｔ— ２ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ ｆＰ＞Ｏ．５０） ｔａｌｉｔｙ ＥＪ］．Ｍｉｌ Ｍｅｄ，２０００，１６５（６）．＇４６６． ３讨论 ［６］Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＴＲ，Ｋｊｅｋｓｈｕｓ Ｊ，Ｂｅｒｇ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ 目前对冠心病模型大鼠制备多是采用高质饮食 ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｉｎ ４４４４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｎａ 喂养造成大鼠动脉硬化，再对大鼠注射大剂量脑垂 Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｍｓｉｓ，２００４，５（３）：８１． ［７］ＲＥＥＤ Ｊ Ｃ．Ｂｃｌ一２ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ［ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８，１７（２５）：３２２５． 体后叶素造成急性缺血引起的叠加模型＿３ Ｊ，但鉴于 Ｅ８ ３Ｆａｎ ＷＸ．Ｅｒｙｔｈｒｏｅｙｔｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ 急性缺血造成的心肌细胞损伤与细胞凋亡有本质不 ｉｎ ｒｕｒａｌ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ，１９９０，５２（６）：１０２７． 同，长期高质饮食也可以引起模型鼠冠状动脉硬化 ［９］Ｇｕｏ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｋ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉｌａ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｅｘ— 改变＿４ｊ。故本实验仅采用高质饮食喂养造模。 ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ａｎｄ Ｂａｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｉｓｃｈｅｍ ｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ Ｊ． 细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，机制相当复 Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔ￣ｈｎｏｌｏｇ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２００８，２８（３）：２８１． ［１Ｏ］杨媛媛，周 刚，马晓康，等．赤芍的研究进展［Ｊ］．医药导报， 杂。研究表明＿５ｌ６ｊ冠心病时心肌细胞会出现不同程 ２００８，２７（１）：６７． 度的凋亡，并且这一改变同心肌细胞凋亡相关基因 （收稿日期：２０１０—１２—１７）
